据可靠估计, 生命科学领域因抗体质量不佳每年的损失达到 8 亿美元,而因此导致的实验失败,实验结果无法重复的严重后果更是无法估量。

 

国际抗体验证工作组(IWGAV)于 2016 9 月在 《Nature Methods》杂志上,发表了一篇题为A Proposal for Validation of Antibodies的文章, 强调了抗体验证需要针对应用和背景来开展。文章提出了五点抗体验证方法,包括遗传策略,正交策略,独立抗体策略,表达标记抗体,免疫捕获+质谱分析。

 

5种方式各有优缺点以及适用条件。以遗传策略为例,遗传方案利用 crispr/cas9 或者 RNAi 技术敲除或者降低目的蛋白表达,再与野生型做平行对照。该方法虽然直接,但是如果基因敲除不成功,该实验方法的可行性将大幅度降低。

 

免疫捕获加上质谱分析方案能够确定与纯化的抗体直接作用的蛋白质,以及可能与目标蛋白形成复合物的蛋白质,但是需要依赖昂贵的仪器和实验材料,对于一般实验室而言,难以普及。

 

Affinity的常规抗体验证采用的是独立抗体策略,找到多个抗体来识别目标蛋白上面的不同表位,通过比较和分析定量来挑选出特异性最高的抗体。这对于一般的抗体检测没问题,但是对于特异性要求极高,尤其是要求位点特异性的磷酸化抗体来说,只这样挑选还不够。

 

Affinity抗体总结多年的研发和生产经验,采用了一个更合适的抗体验证策略:封闭肽+MS验证.

 

 

 封闭肽(即抗原肽),在抗体生产中,封闭肽(blocking peptide-抗体是一一对应的关系,这是只有真正的生产厂家才能提供的最原始的资料。

 

首先我们对封闭肽做质谱分析,确定其序列无误。WB检测时,封闭肽封闭目的抗体,与未封闭组做平行对照,封闭肽将与靶蛋白竞争性结合抗体位点,使封闭组无特异性条带。

 

该策略目前已用于Affinity抗体的验证中,这对于磷酸化抗体的生产尤为重要,确保磷酸化抗体的位点特异性,即磷酸化抗体只识别对应位点磷酸化的靶蛋白,对非磷酸化或其它位点的磷酸化不会识别。

 

 

举例说明:

Phospho-MSK1 (Ser211) Antibody ( 货号:AF7155 )为例,泳道13分别加入非磷酸化封闭肽和磷酸化封闭肽,泳道2未封闭,结果表明添加磷酸化封闭肽后,WB无条带。

 

 

 

如果你对我们的封闭肽有疑问,Affinity全线产品均可提供对应封闭肽用于MS检测,您可以亲自体验并重复我们的抗体验证流程和结果。

 

 

至此,您可能还会有个疑问,既然封闭肽+MS验证这么好,是不是有其它公司也在用?

恭喜你答对了, 以色列alomone ---- 世界最著名的离子通道抗体供应商,凭借700个抗体品种收获全球13000+篇文献引用,采用的即是封闭肽抗体验证,这足以证明封闭肽抗体验证的可靠性。

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